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GB／T 41917-2022 纳米技术 电子自旋共振（ESR）法检测金属氧化物纳米材料产生的活性氧（ROS）.pdf将H2O2用去离子水稀释为浓度为0.1mmol/L的溶液。每个样品准确取样50μL。应 的HO2溶液进行实验。
7.3产生超氧阴离子的溶液制备
用去离子水配制磷酸缓冲液（100mmol/L，pH7.4)。每个样品准确取样70μL。 注1：DTPA用于消除微量杂质金属离子可能造成的人为氧化[2] 注2：整合型离子交换树脂是一种特殊的交换剂或整合剂，可用于制备磷酸盐缓冲液[24.25]
建筑分项安全技术交底书(模板)7.3.2次黄嘌呤溶液
将次黄嘌呤溶解在100mmol/L磷酸缓冲液中制备成浓度为0.125μmol/L的溶液，每 品准矿 取样100μL
7.3.3黄嘌呤氧化酶溶液
GB/T41917—2022/ISO/TS18827:2017
将黄嘌呤氧化酶溶解在100mmol/L磷酸缓冲液中制备成浓度为0.125U/mL的溶液，每个样 角取样10μL。需要现配，在2°℃~8℃储存。
7.4产生单线态氧溶液的制备
含有任何顺磁杂质的自旋捕获剂，都会引起很大的背景和噪声信号，应使用高纯度的自旋捕获 剂，若自旋捕获剂在不含纳米材料的情况下会产生ESR信号，应做对照实验。产生噪声的自旋捕获剂 应使用活性炭等进行预纯化。
7.5.2DMPO储备液
使用的DMPO纯度应≥99%，在一20C避光防潮储存。将DMPO溶解在去离子水中制成 500mmol/L的溶液。测量时每个样品准确取样100gL。
7.5.3BMPO储备液
使用的BMPO纯度应≥99%，在一20C避光防潮储存。将BMPO溶解在去离子水中制成 500mmol/L的溶液。测量时每个样品准确取样100uL
7.5.4TPC储备液
使用的TPC纯度应≥99%。将TPC溶解在去离子水中制成400mmol/L的溶液。测量时每 品准确取样20L
7.6测试样品和自旋捕获剂之间的反应
通过涡旋混合器或移液器混合均匀。不要使用超声处理，因为超声会产生自由基，按照8.1执 行。因为光照也会产生自由基[2，所以制备过程中应避光。所有的自旋捕获剂都要进行基线校准。试 剂的终浓度见表1。
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表1捕获剂的终浓度（续）
7.6.2DMPO的反应
在450μL金属氧化物纳米材料溶液中加人500mmol/L的DMPO50μL储备液，并使用涡旋混合 器或移液器进行混匀
7.6.3BMPO的反应
在450μL金属氧化物纳米材料溶液中加人500mmol/L的BMPO50μL储备液，并使用涡旋混 移液器进行混匀。
7.6.4TPC的反应
在450μL金属氧化物纳米材料溶液中加人40mmol/L的TPC50pL储备液，并使用涡 或移液器进行混匀。
7.7.1DMPO自由基加合物的形成（DMPO/·
7.7.1.1在微量离心管中加人140pL去离子水。
7.7.1.1在微量离心管中加人140μL去离子水。 7.7.1.2再加人500mmol/LDMPO20μL储备液和0.01mmol/LFeSO。溶液20μL。 7.7.1.3加人0.1mmol/LHO20μL开始反应。
2.1 向微量离心管中加人70μL含有25μmol/LDTPA的100mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4) 2.2再加人500mmol/L的BMPO20μL储备液和0.125mmol/L的次黄嘌呤100μL储备液。 2.3加人0.125U/mL的黄嘌呤氧化酶10uL开始反应。
7.7.3TPC自由基加合物的形成（TPC/O2）
7.7.3.1在96孔板中加入100μL去离子水。 7.7.3.2加人40mmol/L的TPC50μL储备液和50pL孟加拉红溶液100μmol/L。 通常情况下，照射10min已经足够。然而，照射时间将取决于光源和光源与样品之间的距离。因 此，应通过实验确定最佳照射时间。 7.7.3.3照射之后，在测量前应将孔板在室温下避光储存，并且照射之后应在短时间内尽快检测。
7.8用于自旋计算的标准物质的制备
将TEMPOL溶解在苯中制成浓度为1.0X10"mmol/L的溶液，用量500μL
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若纳米材料导电，会导致微波功率损失。为防止这一损失，第一种选择是在极低温度下（4K)测 量，以便降低样品的导电率。如果使用此方法，请检查水溶液样品池可耐受的最低温度。第二种选择是 纳米材料与自旋捕获剂反应后，用过滤或离心的方法将其去除。应根据纳米材料的大小和分散性来确 定过滤器的孔径和离心条件。第三种选择是利用数学处理将不均匀的ESR信号扣除[28]。 因为超声处理可能会产生自由基，所以在检测纳米材料产生的ROS时，不应使用超声分散处理纳 米材料[21]。在许多细胞毒性试验中，超声法被广泛应用于纳米材料的分散。因此有必要对超声处理前 后样品的ESR强度进行比较。因为光照也能产生自由基，取样中应避光[26，29,30]。 注1：过滤是插人一个只有液体才能通过的膜将纳米材料与液体分离的一种物理操作。将滤液作为ESR检测的 样品。 注2：采用离心的方法分离纳米材料的悬浮液，用上清液进行ESR检测。 注3：扣除背景是利用数学运算，从与自旋捕获剂反应样品的ESR信号中减去样品自身的ESR信号。
ROS的产生是一个动态过程，其数量和种类通常随时间而变化。此外，自旋加合物的半衰期 下相同。因此制样后要立即进行多次测试。取样后进行ESR测试的最佳时间应通过实验确定。
测试灵敏度与诸多仪器因素相关，例如腔、样品池架、参数等。不同的仪器有不同的设置。表2列 举了ESR测量的参数设置。 ESR波谱仪的操作步骤宜参照所 图1结出工测量流程图
表 超氧阴离子和单线态氧时ESR波谱仪的参数设置
图1ESR波谱测量操作步骤实例
通过毛细作用将样品吸入样品池或用注射器将其注入。 样品注人时避免产生气泡。 测试完成后，转动脱气适配器上的螺钉，排空样品池中的所有剩余物，并用去离子水清洗样品池， 反复几次脱气和排气。如果样品池中部有水残留，将样品池直立，用吸水纸吸去样品池口上的水或将水 抖出，之后加人新的样品。 在阳性对照反应或样品反应后，如果有样品残留（如金属离子、纳米材料)在样品池中，依次用酸性 水溶液（1%~30%的盐酸或硝酸）和去离子水彻底冲洗。
9.3.1打开波谱仪电源开关
打开冷凝水。 不要在仪器附近放置金属物体
9.3.2插入Mn²+标记物
将Mn+标记物置于腔体中。 注1：ESR标记物确保了测量结果可追溯到参考值。此外，它们也常用于测量不确定度评估和校准。 注2：Mn²+的ESR谱图含有6条线，第3条（g因子=2.034)和第4条（g因子=1.981)之间的间隔为8.69mT±
将Mn+标记物置于腔体中。 注1：ESR标记物确保了测量结果可追溯到参考值。此外，它们也常用于测量不确定度评估和校准。 注2：Mn²+的ESR谱图含有6条线，第3条（g因子=2.034)和第4条（g因子=1.981)之间的间隔为8.69mT土
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0.01mT3）。除了这两条线外，其他信号的间距因为随使用额率的不同而改变，不能用于横轴的校准（扫描宽 度）
9.3.3.1*擦去样品池壁的灰尘、水以及其他污染物。 9.3.3.2设定微波功率为“0mW”。 9.3.3.3将样品池竖直插人到共振腔中。每次测量时样品池应在同一个位置。腔的种类对灵敏度有很 大的影响。用“品质因子”（Q因子)来表征腔的性能。Q因子表示腔储存微波能量的效率。波谱仪的 灵敏度随Q因子的增大而增大。液态水会强烈吸收用于ESR测试的微波的能量。如果测试的是水溶 液，应用平底的石英样品池装样品，使样品池薄的部分平行于腔的电场方向（通常情况下是平行于腔的 磁场方向)。 确保样品放在了腔中合适的位置，即在腔的中央。 当插人或拿出样品时，确保微波的能量设为“0mW”
9.3.4.1设置微波功率
将微波功率设置为“1mW”
9.3.4.2设置频率
振荡频率。调节共振峰的峰谷至中心位置，即从
9.3.4.3调整u相位
口相位表示微波的相位，该值无单位。 如果出现图3所示的共振凹陷，调整相位使得凹陷形状呈现出图2（O）
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9.3.4.4调整耦合
这是获得高质量ESR谱中最重要的一步。大多数情况下，仪器的“自动调节”功能即可满足要习 有些情况下，需要手动调节腔体（见图4）
注：耦合过度时腔Q因子低，会导致灵敏度降低。水溶液样品或者导电性样品会出现这种情况。如果用 波导不匹配，通过波导传输的微波能量会被部分反射，导致部分能量未能进人腔体。可通过耦合器 抗与波导阻抗匹配。
合过度时腔Q因子低，会导致灵敏度降低。水溶液样品或者导电性样品会出现这种情况。如果腔的阻抗和 导不匹配，通过波导传输的微波能量会被部分反射，导致部分能量未能进人腔体。可通过耦合器让腔的阻 与波导阻抗匹配。
中心场：320mT~3401
中心场是“磁场的中心”的缩写。 注：尽管信号的线宽会随着谱线峰型（Lorentzian，Gaussian)的改变而发生变化，在确定扫描磁场范围时的一个原 则是谱线线宽的5~10倍。
9.3.5.2扫描步长（±）：5mT~10mT
磁场扫描时所取的磁场间隔。 在0.001mT~750mT之间变化，受中心磁场和
9.3.5.3扫描时间：1min~5min
在0.1s和120min之间变化。当扫描时间介于20s和120min之间时，记录仪将同步于扫描宽度 移动，并将ESR波形记录在图表上。如果扫描快于10s，记录棒则固定在中心。
9.3.5.4振幅：50~300
放大器的增益，数值在1～10000之间变化。 在优化条件下可获得最好的信噪比(S/N)。增益过低会使信噪比变差，增益过高则会使波谱的上 部和下部被削去。
9.3.5.5时间常数：0.03s~0.5s
表示锁相放大器的响应时间。响应时间越长，噪音越小，但响应越差。 时间常数的设置根据信号分裂的精细程度而不同，应仔细选择。当观察超精细分裂时，测量时间应 足够长，否则信号响应不好，波型会发生变形。同样，如果为了消除噪音将时间常数设定成一个较大的 直，信号响应变慢，则需要设置更长的时间常数。因此，扫描时间的设定取决于信号的复杂程度和设定 的“时间常数”，每次测试都应选择和设定。
9.3.5.6调制频率：100kHz
磁场调制的频率。 磁场调制对于获得高灵敏度ESR谱图是不可或缺的。磁场调制的强度与信噪比相关，信号强度的 增强和调制宽度的增加成比例，因此能提高灵敏度。
9.3.5.7调制宽度：0.04mT~0.25mT
磁场调制的强度，在0.0002mT～2mT之间变化，受调制频率限制。 注：若调制宽度太大（比ESR信号宽度更大)，检测的ESR信号会变宽扭曲。但如果太小，则会造成无法接受的低 信噪比信号3]
9.3.5.8接收器模式：1
信号通常为吸收光谱的一阶导数。如果波谱信噪比很高且有些区域需要更好的分辨率，可用二阶 导数表示。
9.3.5.9相位：0°
锁模放大器的相位(粗细调控）。 一般设定为0°
9.3.5.10功率：1mW~40mW
加到反应腔的功率。为确定合适的反应腔功率，需要测试饱和功率。 测试需要的微波输出强度根据测试样品的不同而有所变化，需要对能量进行必要的调整。通过微 波输出功率改变对ESR信号的影响可以确定优化的输出功率。虽然信号强度与微波输出功率的平方 根成比例，但是有一些样品会出现微波强度增大后，ESR信号出现饱和以及波形变形。对于这些会饱 和的样品以及未知的样品（不知是否会出现饱和），通常采用将微波输出分几步从最小值到最大值逐步 进行调整，同时检查信号的强度和波形的形变。在基线实验时确定微波功率并在后续实验中保持不变。
如果信号没有出现在屏幕上或者没有在屏幕中间，将它调到屏
9.3.8记录仪的基线调整
9.3.8.1羟基自由基形成的DMPO/·OH加合物[36.37]
注1：信号强度为1：2：2：1的四重峰。 注2：在去离子水中，aN=aH=14.9G~15.0
注2：在去离子水中，aN=aH=14.9G~15.0G。
图5 DMPO自由基加合物（DMPO/·OH)的形成
9.3.8.3单线态氧形成的TPC/O2[13]
3.8.3单线态氧形成的TPC/O2[13]
图6BMPO自由基加合物（BMPO/·OOH)的形
9.3.8.4TEMPOL标准[39]
PHC锤击桩施工技术交底（工程部）图7TPC自由基加合物（TPC/O）的形成
注1：信号强度为1：1：1的三重峰。 注2：在去离子水中，ag=16.8G。
2：在去离子水中，ag=16.8
9.3.9ROS的定量
某水厂的施工组织设计.docGB/T 41917—2022/ISO/TS 18827:2017
图8TEMPOL标准
在记录仪上记录信号。