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GB／T 41915-2022 纳米技术 MTS法测定纳米颗粒的细胞毒性.pdf8.5验证酶标仪读数一致性
在测定前确保仪器运行正常。
8.6.1对照实验说明
化学阳性对照材料应是CdSO。和带正电的PS纳米颗粒。阳性对照更多的选择细节见5.3。 应单独进行实验以确定纳米颗粒或抗生素是否会对检测产生干扰。 用经过消毒和无内毒素的超纯水（20C时楼梯间饰面砖粘贴施工方案，电导率小于1.1uS/cm）配置储备液。
8.6.2CdSO.储备液的准备（10mmol/L）
处理细胞时，CdSO的浓度应为1μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L和100μmol/ a) 用超纯水溶解并稀释CdSO.至10mmol/L的浓度； b） 将10mmol/L的CdSO保存在4C，无需无菌过滤。
8.6.3纳米颗粒对照悬浮液的制备
用超纯水将带正电的PS纳米颗粒的浓度调整到10mg/mL。 注：在该浓度下，在最大暴露剂量(100μg/mL)时，将在细胞培养基中额外引人1.0%（质量/质量)的水。该储备消 的制备来自附录B中，也将用于下面的实验中。如果储备液中纳米颗粒浓度更低，水在细胞培养基中的浓度会 增加。其他纳米颗粒悬浮液制备见第7章。
表征纳米颗粒对细胞活力的影响
由于纳米颗粒悬浮液可能产生变化，不同时间的3次重复实验应用新配的纳米颗粒悬液。 实验流程如图1所示。
表征纳米颗粒分散体系潜在细胞毒性的简化流程图
.2.1 收集细胞并计数，然后以约7.5×10*cells/mL的密度重悬于培养基中。用细胞计数仪或血球计
数板和体视显微镜测定细胞密度。 一 接种细胞时，细胞密度应合适，检测结束前，细胞不会融合。 一一个培养板需要准备1000000个细胞（约30%过量）。 注：此处的细胞浓度是指96孔板中细胞接种密度1.5×104个细胞/孔。该浓度对附录B中的A549细胞是合适 的。取决于细胞类型、增殖时间和MTS还原活性，该接种密度可以通过预实验加以确定，见9.5.2注1。 9.2.2将含细胞的完全培养基（200μL)转移到第3列～第6列和第8列～第10列的每个孔内，如图2 所示。 9.2.3将不含细胞的完全培养基（200μL)转移到第2列、第7列、第11列的每个孔内（斜杠区)，如图2 所示。每个清亮的孔中接种细胞的密度为1.5×10^个细胞/孔。第2列、第7列、第11列中只有培养 基，第6列仅有含细胞的培养基。 注：使用多通道移液器每次接种一列细跑（见8.7）
数板和体视显微镜测定细胞密度。 接种细胞时，细胞密度应合适，检测结束前，细胞不会融合。 一一个培养板需要准备1000000个细胞（约30%过量）。 注：此处的细胞浓度是指96孔板中细胞接种密度1.5×104个细胞/孔。该浓度对附录B中的A549细胞是合适 的。取决于细胞类型、增殖时间和MTS还原活性，该接种密度可以通过预实验加以确定，见9.5.2注1。 9.2.2将含细胞的完全培养基（200μL)转移到第3列～第6列和第8列～第10列的每个孔内，如图2 所示。 9.2.3将不含细胞的完全培养基（200μL)转移到第2列、第7列、第11列的每个孔内（斜杠区），如图2 所示。每个清亮的孔中接种细胞的密度为1.5×10^个细胞/孔。第2列、第7列、第11列中只有培养 基，第6列仅有含细胞的培养基。 注：使用多通道移液器每次接种一列细胞（见8.7）
9.2.4将培养板轻轻移到37℃土1℃、5%CO2的培养箱中，以便细胞均匀分布。
9.2.4将培养板轻轻移到37℃土1℃、5%CO2的培养箱中，以便细胞均匀分布。 a）孵育24h土2h； b）24h后：用显微镜检查细
.4 将培养板轻轻移到37℃土1℃、5%CO2的培养箱中，以便细胞均匀分布。 a）孵育24h土2h； b）24h后，用显微镜检查细胞是否均匀分布，记录下细胞的状态和形态，
9.3准备纳米颗粒加样板
图2细胞培养板的布局
.3.1图3是加样板的基本设置。第6列和第7列为细胞培养基十1%H2O。第2列～第5列和 列～第11列分别为阳性对照材料和不同剂量的纳米颗粒测试样品。第2列和第11列则为阳性化 和纳米颗粒测试样品的干扰列。样品体积见表2。用8通道移液器将每孔中对应的培养液转移到 反的每行中。
注：图3中纳末颗粒质量分数指第7草的带正电的FS纳术颖粒的意存液。当其他纳术颗粒需安配制成更高质量 分数时，可参照第7章中的建议，以确定纳米颗粒悬浮液在每个剂量组的加人量及分散溶剂的最高质量分数。 2准备加样板的步骤如下： a）参照表2中给出的配制剂量将CdSO加入到第2列～第5列中； b）参照表2中给出的配制剂量将带正电的PS纳米颗粒或纳米颗粒测试样品加人到第8列～第 11列中； c）第6列和第7列各加人含1%H2O的培养基200μL。 注1：培养基中1%的HO含量取决于纳米颗粒储备液的浓度，参见第7章的建议。 注2：在将细胞培养板从培养箱取出前约3h，制备纳米颗粒加样板。这样可以保证将细胞上的培养基去除后即可 加人含不同剂量的纳米颗粒细胞悬液到培养板中，减小了纳米颗粒长时间悬浮在培养基中发生沉淀带来的 影响。
9.3.2准备加样板的步骤如下
加样板中培养基、化学药品、纳米颗粒的剂量配比
9.4细胞在细胞培养液中暴露于纳米颗粒
9.4.1细胞孵育24h后，用吸头从培养孔的底部边缘吸走培养基。
.4.1 细胞孵育24h后，用吸头从培养孔的底部边缘吸走培养基。 4.2用200μL移液器（如多通道移液器）将加样板中样品转移到细胞培养板上。 .4.3将细胞培养板置于培养箱孵育24h。 注：若增加孵育时间（如48h或72h)，可根据本文件方法中的孵育时间进行调整。 4.4 达到指定孵育时间后，从培养箱中取出细胞板。 .4.5用移液器去除含纳米颗粒的细胞悬液和未贴壁的不健康细胞。
9.4.3将细胞培养板置于培养箱孵育24h。
5.1将含MTS试剂（317μg/mL)的培养基加到培养板的各个孔中，每孔200μL。 在移液过程中不要使用排气步骤，以防产生气泡。 5.2含有MTS试剂的细胞放在培养箱（37C，5%CO2）中避光孵育60min。 注1：孵育时间可能因细胞类型、细胞浓度和MTS试剂浓度的不同而不同，特别是使用原代细胞。对新的细胞类 型，需要进行预实验以确定合适的孵育时间。以未处理细胞为例，加人MTS试剂孵育后，吸光度在1～2之间 时的孵育时间为宜。 注2：由于MTS试剂对细胞没有毒性，可以直接加人到含纳米颗粒的培养基悬浮液中，可省略去除纳米颗粒悬浮液 的步骤。需要注意的是，当纳米颗粒自身的吸光度对检测体系不产生干扰时，此简化步骤才适用。
9.6.1设置酶标仪，以便记录每个待测孔的吸光度值。
用酶标仪测定在490nm处的吸光度。 2 测量每个孔的吸光度，注意产生气泡的孔。 注1：如需考虑培养孔中光程问题（气泡、手印等），可以选择MTS试剂无吸收的波长（650nm)作为参考。如果发现 在此参考波长下不同孔的吸光度存在显著差异，则表明这些孔可能存在光程受阻问题。这一步在使用前需要 先验证。 注2：在NanoGo纳米颗粒细胞毒性实验室间比对研究中，在读数前进行了离心处理，以便将所有的纳米颗粒从 MTS细胞混合液中去除。即与MTS试剂孵育后，把细胞培养板以2000g的离心加速度离心10min，将上 清液转移到一个新板进行光学读数。本文件中也可以参照进行。但更广泛地使用这一离心步骤还需进 步验证。
建立一个简单的电子表格的毒性数据分析。 a) 1 将培养液中纳米颗粒的平均背景水平吸光度（第11列)从每个孔中减去。 b） 将每个加样复孔测得的吸光度对未处理孔(B行)的吸光度进行归一化。这些去掉背景和归 化的数值代表加样处理后仍有活力的细胞。 ? 1 归一化后，算出同一加样组（第3列～第5列和第8列～第10列)中该剂量细胞活力的平均值 和标准差。 d）如果测到细胞毒性，用GraphPadPrism或其他软件对数据进行处理，估算出ECso值和95%置 信区间。 若某一处理促进了细胞增殖，细胞活力会有所增加。其他增殖试剂盒，如BrdU或细胞计数可用于 这一结果。
可以用第11列的培养孔平均吸光度和偏差来评估纳米颗粒对光程造成的干扰。如果这两个值与 第7列MTS试剂的差异很显著，则表明纳米颗粒可能对检测有干扰[25]
MTS法是一种筛选检测方法，可通过与生物细胞的相互作用快速评估其潜在毒性。一般来说， 检测方法不足以充分说明纳米颗粒的毒性。因此，该方法的测量结果应与其他检测方法相结合 好地理解毒性作用机制和将数据用于风险评估模型。
GB/T 41915—2022/ISO19007:2018
本草案是附录C中未经同行审阅的IANH草案的扩展。本草案包括加样板制备和更多细胞处理 的具体细节。A549细胞被用于评估带正电的PS纳米颗粒和二氧化铈纳米颗粒的细胞毒性效应。使 用该方案在5个国际测量实验室进行了实验室间比对。具体实验设计见参考文献6。比对结果汇总在 附录B最后。与NanoGo草案区别之处是本草案未使用离心步骤来降低纳米颗粒可能产生的干扰。
草案的修订版评估纳米颗粒对A549细胞的毒性
A549，人上皮细胞；癌症转化株（经DNA鉴定确认）应无支原体污染
B.2.2.3化学品和血清
所有溶液（除培养基）、玻璃器皿等都需要灭菌处理，且所有操作步骤都应在无菌条件下、无菌 （符合生物安全级别）上操作
除培养基）、玻璃器皿等都需要灭菌处理，且所有操作步骤都应在无菌条件下、无菌操作 全级别)上操作。
B.3.2.1完全培养基
NB／T 10475-2020标准下载B.3.3.1细胞复苏
一且复苏，在实验之前细胞要传代至少两次。细胞传代培养不应超过3个月。 复苏后的第一代培养过程中，细胞可能生长缓慢
B.3.3.2细胞生长[19
用20mL完全培养基将细胞培养在一个75cm²培养瓶中放置在标准培养条件下（37C，5% CO2，加湿的空气）的培养箱中培养。 注1：A549细胞需在完全细胞培养基中培养（见试剂准备部分C3.2)。 注2：A549细胞生长迅速，24h内迅速倍增。当细胞生长在含酚红的培养基中，培养基颜色由红变黄可能意味着生 长过度（即营养素耗竭）。
用20mL完全培养基将细胞培养在一个75cm²培养瓶中放置在标准培养条件下（37C，5% CO2，加湿的空气）的培养箱中培养。 注1：A549细胞需在完全细胞培养基中培养（见试剂准备部分C3.2)。 注2：A549细胞生长迅速，24h内迅速倍增。当细胞生长在含酚红的培养基中，培养基颜色由红变黄可能意味着生 长过度（即营养素耗竭）。
B.3.3.3细胞收集
养瓶中吸走培养基，并用20mLPBS洗涤细胞两
B.3.3.4计数细胞确定细胞的健康状态
B.3.3.4.6血球计数仪板共有8个正方形计数室，数角上（图B.1中的A1、A3、A7、A9、B1、B3、B7和 B9)4个1mm²正方形上的所有细胞数（染上蓝色代表死细胞，活细胞没有颜色）。如果超过25%的细 胞死亡，细胞状态不好。应丢弃当前的细胞悬液步行道绿化工程施工组织设计方案，重新养细胞。 注：如果大正方形中细胞数小于50或大于200，需调整合适的稀释倍数，重新计数。 B.3.3.4.7用以下公式计算每单位体积中细胞的数目（cells/mL)：细胞数=平均细胞数×稀释倍 数×10*/mL。