1. 适用范围
适用于水产品（鱼、蟹、虾、甲鱼等）中孔雀石绿和隐形孔雀石绿的检测。
2. 提取
称取相当于原始样品5 g样品(精确至0.01g)制备好的试样，置于50mL塑料具塞离心管中，加入10µL 1μg/mL的混合内标标准溶液，依次加入1 mL 0.25 g/mL盐酸羟胺溶液、2 mL 1.0 mol/mL对甲苯磺酸溶液、2 mL 0.1 mol/L pH=4.5乙酸铵缓冲溶液，摇匀后，加入30mL乙腈，剧烈振摇2min离心5 min(4000r/min)。将上清液转移到250mL分液漏斗中，用30mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液。于分液漏斗中加入50mL二氯甲烷30 mL水，振摇2分钟静置分层，收集下层有机层于250mL旋蒸瓶中。45 ℃旋转蒸发近干。
在旋蒸残渣中加入5mL 乙腈，漩涡振荡器，溶解残渣，待净化。
3. 净化
活化/平衡：将Welchrom® PRS 500mg/3mL (P/N：WSS46PR0305)（上海月旭提供）安装在固相萃取装置上，上端连接Welchrom® Alumina-N 1g/6mL（P/N：WSAN010610）（上海月旭提供），用5 mL乙腈活化小柱，流出液弃去；
上样：将上述待净化液加入柱中，流出液弃去；
淋洗：用5 mL乙腈淋洗小柱后，弃去中性 Welchrom® Alumina-N小柱，然后将PRS抽干；
洗脱：5 mL乙酸乙酯：甲醇：氨水（50:45:5）混合溶液洗脱，收集洗脱液
40℃氮气吹干，1 mL流动相溶解，0.22μm针孔滤膜过滤后，待分析；
4. 色谱质谱条件
4.1 色谱条件
色谱柱： Xtimate C18 液相色谱柱（2.1mm*50 mm 3 μm）（上海月旭提供）
流动相：
A: 0.1%甲酸+2 mM乙酸铵水溶液
B：乙腈
梯度洗脱
流速：0.4 mL/min
进样量： 10 μL
柱温：40°C
运行时间：12 min
4.2 质谱条件
扫描模式：MRM
离子源：ESI+
毛细管电离电压：3000v
干燥气温度：350 ℃
干燥气流速：11 L/min
雾化器压力：50 psi
| 名称 | 母离子 | 子离子 | 碎裂电压（Fragment） |
驻留时间 （ms） |
碰撞能量 （V） |
定量离 子对 |
定性离 子对 |
| 孔雀石绿（MG） | 329.2 | 313.1 | 140 | 30 | 40 | + | - |
| 208.1 | 140 | 30 | 38 | - | + | ||
| 隐性孔雀石绿(LMG) | 331.2 | 316.1 | 140 | 30 | 20 | + | - |
| 239.1 | 140 | 30 | 36 | - | + | ||
| MG-D5 | 334.2 | 334.2 | 140 | 30 | 318.2 | - | - |
| LMG-D6 | 337.3 | 337.2 | 140 | 30 | 322.2 | - | - |
5. 结果
5.1 回收率和重现性实验
将猪肌肉空白样品经过液液萃取初步处理后，分别添加一定量的标准溶液，添加浓度分别为0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/ kg、每批次内同一浓度做3次平行实验，共3个批次（样品典型回收率色谱图见附图）。
| 添加水平（μg/kg） | ||||||
| 分析物 |
0.5 | 2 | 10 | |||
| Recovery (%) | RSD (%) | Recovery (%) | RSD (%) | Recovery (%) | RSD (%) | |
| 孔雀石绿 | 110.8 | 7.53 | 98.1 | 6.56 | 96.1 | 4.71 |
| 隐性孔雀石绿 | 95.3 | 7.43 | 103.5 | 3.42 | 97.4 | 4.55 |
图1 鳕鱼中添加0.1 mg/kg 盐酸克伦特罗EIC谱图 图2 鳕鱼中添加0.1 mg/kg 莱克多巴胺EIC谱图
相关标准：
GB 10136-2015 食品安全国家标准 动物性水产制品
GB 2733-2015 食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品