GC/MS法测定牛肝、肾和肉中 -感动剂的三甲基硅烷衍生物（EEC，筛选法）
β-Agonists-A Screening Method for the Detection ofβ-Agonists in Bovine LiverKidney and Meat by GC-MS in the ElectronImpact Mode for the Trimethylsilyl derivatives
(EEC Screening Method Sg2.4)
1 主题内容
这是一种多残留说明要领，描写了残留于小牛和成年牛的肝、肾和肉的样品中，12种单体 -感动剂测定要领。该要领是法兰西的官方要领，与欧共体残留导则（86/469/EEC）的原则保持同等。
2 应用范畴
该要领用于一般筛选说明小牛和成年牛的肝、肾和肉样品，测定样品中的clenbuterol clenpenterol hydroxymethyl-clenbuterol salbutamol terbutaline cimaterol cimbuterol mabuterol mapenterol tulobuterol fenoterol和ractopamine等 -感动剂的残留量。要领的检出限被界说为当信躁比 3时，大大都 -感动剂的检出低于2 g/kg。
3 参考资料（略）
4 界说
-感动剂的含量是指被测定样品中 -感动剂的物质的量，按照以上对本要领所作的描写，它应该表述为 g/kg样品（肝、肾和肉）。
5 要领道理
本要领由8个部门构成。
⑴ 样品用Stomacher均质器和超声波装备均质。
⑵ 共轭物的水解。
⑶ 酸沉淀。
⑷ 液液萃取。
⑸ 用殽杂固相色谱提取法对萃取溶液举办净化和浓缩。
⑹ 衍生回响。
⑺ 用GC-MS电子轰击源举办测定。
⑻ 功效的计较和评价。
6 尝试原料
留意：回响试剂（包罗仪器装备）的来历都应该切合要求，不外差异来历的试剂和装备可以等同行使。所有试剂都必需说明纯或高于说明纯。
6.1 尺度品
氯化克喘素
Salbutamol hemisulphate Terbutaline hemisulphate，metoprolol tartrate。
Cimaterol Clenpenterol（NBA 760） mabuterol fenoterol hydrobromide ，hydroxymethyl clenbuterol（NA1141）（Boehringer Ingleheim公司）。
Tulobuterol hydrochloride（Abbott公司）。
Ractopamine hydrochloride（Eli Lilly公司）。
Cimbuterol，marpenterol 由法兰西Rennes大学化学系合成。
6.2 化学药品和试剂
6.2.1 Helix pomatia果汁（ -glucuronidase-arylsulfatase Merck-4114）。
6.2.2 冰乙酸
6.2.3 超纯水： 14 M .cm。
6.2.4 甲醇
6.2.5 乙酸乙酯
6.2.6 32 的氢氧化铵
6.2.7 1 mol/L氢氧化钾
6.2.8 1 mol/L乙酸
6.2.9 N-O-双-(三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）（Regisil-270111或FLUKA-15244）。
6.2.10 甲苯分子筛
6.2.11 乙酸钠
6.2.12 磷酸二氢钾
6.2.13 氮气:通过硅胶干燥
6.2.14 高纯氦气
6.2.15 70 高氯酸
6.2.16 氯化钠
6.2.17 异丙醇
6.2.18 氮气
6.3 溶液
6.3.1 -感动剂：以甲醇为溶剂制备尺度储蓄溶液，浓度别离为1g/L和100 mg/L（6.1.1），在-18℃贮存。
6.3.2 -感动剂：以甲醇为溶剂稀释尺度储蓄溶液（6.3.1）以制备尺度事变溶液，浓度别离为10 g/mL和1 g/mL，在-18℃贮存于黑漆黑。
6.3.3 0.2mol/L pH=5.2乙酸钠缓冲溶液，用于共轭物的水解。制备操纵为消融16.4g乙酸钠（6.2.11）于900mL水中（6.2.3）用冰乙酸（6.2.2）调理pH到5.2 0.1，最后用水稀释到1L，在+4℃贮存，行使期为1个月。
6.3.4 pH=6，0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。消融13.6 0.1g磷酸二氢钾（6.2.12）于900mL水中（6.2.3），用1mol/L的氢氧化钾（6.2.7）调理pH值到6.0 0.1，最后用水稀释到1L，在+4℃贮存，行使期为1个月。
6.3.5 以97﹕3（v/v）殽杂乙酸乙酯和32 的氢氧化铵。每100mL可做16个样品。行使前搅拌或动摇，而且在后头的9.13.3步操纵时代，同时接管超声波水浴的处理赏罚。
6.3.6 0.1 mol/L高氯酸（PCA）沉淀剂:用水稀释8.6mL 70 高氯酸到体积为1升。
6.3.7 1 mol/L乙酸:用100 mL水稀释5.6 mL的冰乙酸（6.2.2）。
6.3.8 体积比为40：60的异丙醇和乙酸乙酯殽杂溶液:殽杂400 mL的异丙醇和600 mL的乙酸乙酯。
7 仪器装备
7.1 离心机。
7.2 旋转蒸发器。
7.3 程度振荡器。
7.4 Stomacher（Cofralab-07555526）和塑料袋（Cofralab-07556952）。
7.5 超声波水浴。
7.6 搅拌机或碎肉机。
7.7 真空过滤体系（Vac-Elut from Analytichem International）。
7.8 超声波探头（Cofralab-07580740）。
7.9 磁搅拌器或磁振荡器。
7.10 衍生回响用的圆锥型回响小玻璃瓶 。
7.11 加热圆锥型回响小玻璃瓶（7.10）用的加热块。
7.12 配有吹氮气装置的旋转蒸发体系。
7.13 固相提取柱（SPE-柱）：CLEAN SCREEN DAU IM6（Worldwide monitoring - Horsham PA USA and sold by Technicol Stockport Cheshire UK）。这些柱子含有1000 mg的殽杂相担体，具有憎水性和离子互换的性子。
7.14 GC-MS。
7.14.1 气相色谱仪：HP 5890。
毛细管色谱柱：30 m 0.25 mm内径，具有0.25 m膜厚的SE-30牢靠相。
进样模式：不分流进样高出1min。
进样体积：2 L。
进样器温度：250℃；接口温度：280℃。
升温措施：
70℃（2min） 18℃/min 200℃（0min） 5℃/min 245℃（0min）25℃/min 300℃（12 min）
载气:高纯氦，流量1 mL/min；压力5 psi。
7.14.2 质谱仪（MS）：HP 5971，具有UNIX计较机事变站。
电子轰击离解模式：70 eV。
离子源温度：190℃ 5℃。
离子源真空度：30-40毫乇。
离子质量：见表1。
表 1
-感动剂的名称 N RT（分） 选择离子 分子离子
Tulobuterol 1 9.34 86194284 299
Mabuterol 1 10.36 86277296 382
Mapenterol 1 11.04 100277296 396
Terbutaline 3 11.67 86356 441
Clenbuterol 1 12.02 86243262(264) 348
Cimaterol 1 12.14 72219 291
Salbutamol 3 12.27 85369 455
Cimbuterol 1 12.36 72291 305
Cimaterol 2 12.62 27223 363
Metoprolol(I.S) 1 12.7 86291 339
Cimbuterol 2 12.8 100243262(264) 377
Clenpenterol 1 12.86 174243262 362
Hydroxymethyl-
clenbuterol(NA
1141) 2 14.05 322256412 436
Fenoterol 4 18.39 250267 591
Ractopamine 3 18.63 517
表中的N代表三甲基硅烷基的数量，RT是在LDH，Nantes所做的一次说明中记录
到保存时刻。
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8 样品和取样措施
留意：寄望6.3.1节和国际尺度化组织文件78/2-1982（E）以及由文件2052/Ⅵ/84-EN 的附件Ⅱ导出的下列通则。
8.1 样品性状:即必需切合导则64/433/EEC中界说的内容，使可以或许举办肝、肾和肉样中残留物的测定。
8.2 样品量:样品量要大到足以完成测定以及一再测定的要求。本要领测定β-感动素作一次测按时所要求的样品量为10g。
8.3 样品收罗和包装的要领:必需使尝试室易于辨别和行使。
8.4 样品的包装、贮存和运输的要领:必需担保样品的完备性，不能影响测试的功效。
在48小时内就做 -感动素说明的样品，必需贮存于冰箱内。48小时往后才做说明的样品，必需在低于-18℃的温度下贮存。
9 操纵步调
9.1 支解约15g的低级样品，放进一台搅拌机或碎肉机中，使样品绞碎。但对肝样品来说，可不必这样做。
9.2 称出10 1 g的碎样，放入一个Stomacher口袋中，加进去15 mL pH=5.2的乙酸盐缓冲溶液（6.3.3），均质5分钟。
9.3 将袋中内容物转移到一个25 mL的烧瓶中。
9.4 将超声波探头（7.8）伸进烧瓶中，超声0.5秒钟，守候5秒钟后再超声0.5秒钟。对肝和肾样品一再这一操纵10次（总时刻为50秒），对肉样品一再这一操纵20次（总时刻为100秒）。
9.5 添加120 ng的metoprolol作为内标物质插手肝、肾和肉样中，包罗空缺的肝、肾和肉的样品，含量相等于12 g/kg样品。
9.7 取出一个肝、肾和肉的空缺样品，添加120ng的metoprolol尺度物质（相等于样品中含量为12 ppb），80 ng的tulobuterol fenoterol 和ractopamine尺度物质（相等于样品中含量为8 ppb），40 ng的其余 -感动剂尺度物质（相等于样品中含量为4 ppb）。
9.8 加50 L的Helix pomatia果汁（6.2.1），安排于50℃（42 52℃）的水浴中或烘箱内，安排留宿。
9.9 将颠末水解的肝、肾和肉样品转移到一个聚乙烯离心管中。
9.10 插手10 mL 0.1 mol/L的高氯酸（6.3.6），殽杂匀称并用70 的高氯酸（PCA）（6.3.15）调理pH值到1 0.3。
9.11 以7000转/分的转速离心25分钟后，将上清液转移到一根玻璃离心管中。
9.12 用氢氧化铵溶液（6.2.6）调理pH值到9.5 0.3。
9.13 用氯化钠饱和水相。
9.14 加25 mL 的异丙醇和乙酸乙酯的殽杂溶液（6.3.8），置于一个程度振荡器上振荡15分钟。
9.15 以3000-4000转/分的转速离心15分钟。
9.16 转移有机相到一个250 mL的旋转蒸发热瓶中。
9.17 再用15 mL的异丙醇和乙酸乙酯的殽杂溶液（6.3.8），提取水相一次，归并有机相。
9.18 在一个旋转蒸发器上，以45 5℃的温度，蒸发有机相至干。
9.19 以8 mL的磷酸盐缓冲溶液（6.3.4）使蒸发残渣成为悬浮液后，转移到一根溶血用的试管中，再用 4 mL的磷酸盐缓冲溶液洗涤烧瓶后，并入适才的溶血用的试管中。
9.20 以2000-3000转/分的转速离心15分钟。
留意：这一步操纵是很重要的，当旋转蒸发操纵之后呈现了固体残渣时。
9.21 将液相倾入一根试管中，再插手3mL磷酸盐缓冲溶液（6.3.4）。
9.22 固相提取（SPE）柱提取。
9.22.1 将色谱柱至于一种真空洗脱体系之上，别离用4mL甲醇，4mL水（6.2.3）和4mL磷酸缓冲溶液（6.3.4）依此洗涤柱子。
9.22.2 用巴氏消毒的移液管，将清澈的提取溶液转移至色谱住的顶部，轻微施加一点负压（约为5cm Hg柱）*惕迟钝地抽吸色谱柱。此步操纵至少必要10 分钟。
9.22.3 用40 cm Hg柱的负压，2 mL 1M的乙酸（6.2.8）洗涤柱子到干后至少15分钟，
最后用12 mL甲醇和较强的负压洗涤柱子至干后至少10分钟。
9.22.4 在举办9.22.3步的操纵时代，将乙酸乙酯和氢氧化铵殽杂溶液（6.3.5）放在一个超声波水浴中殽杂匀称待用。
9.22.5 用12 mL上一步殽杂匀称的乙酸乙酯和氢氧化铵殽杂溶液，洗脱柱子上的待说明因素。
9.23 通氮气在温度为40 5℃的加热块上蒸发洗脱液。
9.24 插手200 L甲醇，强烈涡流动摇，消融蒸发残渣。
9.25 将溶液转移至一个回响玻璃小瓶中。
9.26 再用100 L甲醇消融上一步未消融完全的残渣，溶液归并进回响玻璃小瓶中。
9.27 在温度为40 5℃的加热块上蒸发甲醇至干。
9.28 衍生化回响。
9.28.1 插手50 L的N-O-双-（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA），并强烈涡流动摇。
9.28.2 将回响小瓶安排在75 5℃ 的加热块上安排90 15分钟。
9.28.3 将回响小瓶转移至一个温度为40 5℃ 的加热块上，让小瓶和加热块冷却到室温（25℃）后，通氮气流蒸发至干。
9.28.4 插手25 L甲苯（6.2.10）强烈涡流动摇消融蒸发残渣。
9.28.5 小瓶可以贮存于温度为 +4 ℃的冰箱内。
9.29 打针2 L上一步操纵中的溶液进入GC-MS。
9.30 GC-MS仪器说明体系。
GC-MS仪器说明体系以选择性离子监督运行， -感动剂衍生物的保存时刻罗列在7.14.2的表1中。
10 对功效的说明
10.1 说明功效的正当性；欧共体第256号决策中关于功效的尺度表述都应该做到，尤其是对下列内容。
10.1.1 在恰当基质中尺度被说明物的三甲基硅烷衍生物，与被猜疑的响应的 -感动剂的三甲基硅烷衍生物，它们的相对保存时刻，必需是沟通的。
10.1.2 被选择离子对基峰的相对品貌，与空缺肝、肾和肉样中添加的尺度物的响应离子对基峰的相对品貌，必需是沟通的。
10.1.3 内标尺度物的离子（metoprolol-单体三甲基硅烷衍生物离子），必需呈此刻正确的相对保存时刻的位置上。
10.1.4 添加有内标尺度物的空缺肝、肾和肉样的说明功效，必需确保没有来自GC-MS体系中残留 -感动剂的任何孝顺，即 -感动剂的含量不能高出添加量。这也是对体系是否有污染的一种查核。
11 非凡事例
12 要领留意点
13 质量节制
参看关于 -感动剂的RMs具体手册的第8节的内容。
14 检讨陈诉
15 缩略语列表
一分全面的缩略语列表放在附件I的第12节。
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16 尝试流程图
肝肾肉样品 (均质) ——————→ 高氯酸沉淀 ——————→ 提取
1.溶剂液液分派萃取
2. 固相提取柱色谱
计较功效 ←——— GC-MS ←——— 三甲基硅烷化衍生