大米直链淀粉含量测量和淀粉分子旋转半径的研究实验

作为主要的能源物质，淀粉是人类的主要食料。大米淀粉因其颗粒粒径小，色泽白，易消化等优异品质，成为淀粉家族中颇为醒目的一员，正日益受到食品研究者和制造商的关注川。随着农产品生产水平的提高和人们对高品质、健康食品需求的增加，大米淀粉在食品工业中的需求不断增大口大米淀粉的主要成分是直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉含量高的大米淀粉产品受热糊化后容易老化，而含量低的产品易于糊化，不容易老化。直链淀粉含量低的大米*后表现为钻性大、米饭软且有光泽，而含量高的大米*时会吸收较多的水分而不断膨胀，饭粒干燥、蓬松且色暗。可见大米淀粉中的直链淀粉是影响淀粉糊化、胶凝、老化等性质的重要因素之一，不仅影响大米淀粉的*和加工特性，而且还影响到大米淀粉在作为添加剂和功能性组分方面的性质。因此，使用直链淀粉测量仪对大米直链淀粉进行有效的分离，进一步了解直链淀粉的分子结构，以便建立起结沟与性质的关系，已成为区分大米淀粉产品品质的关键。

       国 内外 对 于淀粉分子结构与品质关系的研究由来已久。由于直链淀粉分子量巨大，没有有效的溶剂溶解样品.同时缺乏有效的手段从淀粉中分离直链淀粉，所以国内几乎没有关于直链淀粉分子量的报道。而国外对于淀粉分子量的报道也因仪器分析方法的不同而千差万别[3到泪前为止，仍未能得到关于直链和支链淀粉分子量的确切信息。本实验通过使用流变仪控制不同直链淀粉含量的大米淀粉的升温糊化过程，用浸出法分离出大米淀粉中的直链淀粉，并用高效液相分子排阻色谱(HPSEC)与多角度光散射仪(MALLS)及折光检测器(R”连用系统分析分子量分布及分子旋转半径，旨在建立有效的分析直链淀粉分子量的方法，提供确切的直链淀粉分子结构方面的信息，为国内大米淀粉的工业化应用提供帮助。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
       大 米 淀 粉样品:Cocodrie(直链淀粉含量21%)L-205直链淀粉含量17%)和Koshi(直链淀粉含量14%)由项目合作单位美国加州大学Davis分校食品系提供。

1.2 主要试剂和仪器
      二 甲亚 矾(DMSO)(色谱纯，Sigma公司);滨化锉(分析纯，Fishe:公司);葡聚搪分子量标准(T40和T2000P harmacia公司)。高效液相色谱仪(HPSEC)(美国惠普公司)，化学工作站，自动进样装置;多角度光散设仪Dawn DSP-F (MALLS)(美国Wyatt公司);折光检测器ERC-7512( RI) (日本ERMA公司);AR1 000流变仪(美国TA公司);UV1100分光光度计(北京瑞利公司)。

1.3 试验方法
1.3.1 样品制备和处理
1) 标 准 样品的处理:将20m g葡聚搪标准样品(T40或T2000)溶解在5 mL DMSO/50 mmol/L     LiBr溶液中，配制成为浓度0.4 %的溶液。室温下搅拌2h 13500r /min离心10m in取上清液，经过0.4 5K m的微孔膜滤后进行HPSEC-MALLS-RI分析。
2) 淀 粉 样品的制备和处理:20m g淀粉样品溶解在5 mL DMSO/50 mmol/L LiBr溶液中，配制成为浓度。.400的淀粉溶液，加人磁力搅拌子，在磁力加热搅拌器上，于90℃下加热搅拌1h后于室温下继续搅拌24 h 13500 r/min离心10 min后取一清液，经过0.45Km的微孔膜滤后进行HPSEC-MALLS-RI分析。
3) 直 链 淀粉样品的制备和处理:根据Mua等的方法[s}加以修改。3%的淀粉样品被置于AR10o0流变仪平台上。流变仪的夹具选择4040 mm的锥板，夹缝设置为I mm流变仪的程序选用稳态流动(Flowprocedure):50 C 保持1m in，接着从50℃以10C / min分别程序升温到75'C80C85C和90'C 剪切速率为200 a-'程序结束以后流变仪平台上的样品用吸管完全转移至离心管中，以13500 r/min离心10 min后弃去沉淀取上清液即为直链淀粉样品，取0. 2 mL上清液作波长扫描分析，其余上清液经过。. 45 jm的微孔膜滤后进行HPSEC-MALLS-RI分析。

1.3.2 直链淀粉样品的波长扫描
        根 据 Ch eethan的方法，并加以适当修改进行波长扫描。取直链淀粉样品(上清液)0.2 m L，加人含。.006mol/L碘的90%的二甲亚矾溶液8 mL在室温下反应24 h，其间不时搅拌溶液，再取1 mL溶液与8 mL去离子水混匀，静置30 m。后，以试剂作为空白，在250-800 nm波长范围内进行波长扫描Cs7
1.3.3 色语往和多角度光散射仪条件St yra ge l预饱和柱，Styragel HMW7 StyragelHMW6和Styragel HMW2柱(Waters公司);流动相采用含有50 mmol/L LiBr的二甲基亚讽溶液;流速为0. 6 mL/min;柱温用柱温箱保持在40'C;多角度光散射仪的光源气体使用氦气和氖气，波长选用623. 8 nmC'7.
1.3.4 数据处理
         使 用 A stra( version 3.4 .W yatt ThchonlogySanta Barbara CA)数据分析软件对数据进行分析和处理。

2 结果与分析
2.1 参数的设定和仪器的准确性检验
2.1.1 数据处理与参数的设定
         目前 ，凝胶色谱和排阻色潜是最广泛应用的测定分子量的两种技术。通常需要已知分子量的标准样品，但在淀粉分子量M量中却很难找到组成结构和分子量与待测淀粉接近的标样。排阻液相色谱和多角度光散射仪、折光检测器连用技术(HPSEC-MALLS-RI)使淀粉分子量的测定成为可能。当一束光照射到某一介质时，能够在各个方向观察到光强度，其散射光的强度与溶液中分子大小、形状和分子间的相互作用有关。重均分子量Mw 和分子平均旋转半径的关系由以下公式来表示[CIO]
K' c / R = [1+ (16r'/3A 2)<rg2> sin2(8/2)+几 sin '(8 /2 ) + .. .]/ M u + 2 A c式中Ra— 瑞利Rayleigh因子，表示散射角为0时的光散射强度;c- 高聚物溶液的浓度;Mw 高聚物的重均分子量;A— 第二维利系数，代表了溶剂和溶液之间的相互作用大小;< rgz >— 平均旋转半径的平方;K' = 4 rr' no (d n/ dc) '/ VN e式中、— 溶液的折光指数;do/dc— 在一定的波长下，折光检测器RI随着高聚物浓度变化而发生的改变;N— 阿佛加德罗常数;x— 人射光的波长。当 高 效 液相分子排阻色谱(HPSEC)与多角度光散射仪〔MALLS)及折光探测器〔RI)连用时，分子排阻就可以测得K' cBR。和A，而Mw G rg2> 和A:则是需要通过计算求出的。在上式中，当外推到浓度‘~。，散射角0-。时，则K' c /RB- 1/ Mw1/ M u即为截距.由此可以得到mw.根据Millard等文献记载[+7，采用多角度光散射仪测定高聚物分子质量及平均分子半径时，应选用较小的散射角，本实验选择最适角度为2，选择散射角较小的1-V14个检测器的数据。得到的检测数据依据Berry提出的方法进行曲线拟合甲用Astra数据分析软件对数据进行分析处理。

2.1.2 仪器的准确性检脸
      葡 聚 糖 样品T2000和T40首先作为标样进入HPSEC-MALLS-RI体系以验证该体系的准确性，并建立多角度光散射仪的各项参数和标准。图1显示的是其HPSEC-MALLS-RI色谱图淀 粉 是 一个多分散体，有一个分子量分布范围。图1中呈抛物线分布的为折光检测器检测到的流动相不同流出体积下的样品的浓度，皇线性分布的为在各个浓度下对应的分子量分布，可以看到最先流出的是分子量最高的部分，后流出的是低分子量部分，图中的分子量呈从高到低线性分布。通过Astra软件分析计算，由HPSEC-MALLS-RI系统测得的T2000和T40的重均分子量Mw分别为1.95X10‘和3.89X10'，与该两种标样的实际重均分子量(2.0X10'和4.0X10')十分接近，说明由HPSEC-MALLS-RI体系结合Astra软件通过second order Berry外推法测定高聚物的分子量分布具有较高的准确性.因此，后面的测定均以葡聚搪样品T200。和T40作为标准、即以其侧定时的各项参数作为统一标准来设定多角度光散射仪的参数。
2.2 大米淀粉样品的HPSEC-MALLS-RI分析
      淀 粉 在水 性溶剂中的溶解性很差，目前最常用的溶解淀粉的溶剂为二甲亚矾，研究表明，在二甲亚矾中加人少量水或加人一些分子质量较小的电解质有助于淀粉分子的溶解[312]，但是，已经报道的大米淀粉的分子质量存在非常大差异，大约为0.39X 103-7.510X103[3.12]。这一方面可能是大米来源不同造成的，另一方面也说明淀粉的真正分散利溶解还存在问题[13]。本实验小组在前期的研究工作中比较了不同溶剂对大米淀图 2 为 Cocodrie大米淀粉的HPSEC-MALLS-RI图谱。通过Astr。软件析Cocodrie大米淀粉的重均分子量Mw为9.2X10'，分子平均旋转半径为222. 6nm。可以看到，图中只出现一个峰，即两者在分子排阻色谱往中并没有得到很好的分离。尽管直链淀粉和支链淀粉的分子量(Mw)存在很大的差异，但其旋转半径(RMS)非常接近.因此在通过高效液相分子排阻色谱(HPSEC)分离时，图谱中对应于直链和支链淀粉的两个峰并没有分开。分子量分布曲线表明，任一时间流出的样品的分子量都没有接近直链淀粉的分子量，实验得到的分子量，是直链淀粉和支链淀粉聚集以后的平均分子量。因此，无法实现直链和支链淀粉的分子排阻色谱的真正分离。只有事先将直链淀粉分离出来，才能有效的测定其分子量分布。

2.3 大米直链淀粉样品的分离
      直 链 淀 粉在一定的温度下可以从淀粉颗粒中游离出来并溶解在水中，而支链淀粉只有在完全糊化后才可以在水中良好的分散。直链淀粉的浸出温度可以从淀粉糊化曲线中的起始糊化温度到达峰值温度之间的任意温度区域进行选择。依据这一原理使用AR 1000流变仪控制大米淀粉的升温糊化过程，在糊化起始温度到峰值温度之间的不同温度取样并离心，得到的上清液即为不同温度下浸出的直链淀粉。3种 大 米 淀粉的糊化温度和峰值温度数据均由美国加州大米研究基金协会提供，见表1。对于直链淀粉含量较低的Koshi，其糊化温度较其它两种淀粉低，因此，实验分别在70C75‘C80C85℃和90C取样.而L-205和Cocodrie淀粉则分别在75C80C85C和90℃取样，得到的样品立即离心，弃去沉淀，取上清液进行分析。上清液通过与碘显色反应呈现蓝色，经过波长扫描后得出其最大吸收波长为640 nm，这些都是直链淀粉的特征阁，证明上清液中绝大部分为直链淀粉，而且在上述各个温度下都有直链淀粉溶出。因此，用流变仪控制糊化升温来分离直链淀粉是一种有效的方法。
2.4 大米直链淀粉样品的RPSEC-MALLS-RI分析
      经 过 分 离得到的直链淀粉再经过HPSECMALLS-RI系统进行分析，不同温度下浸出的直链淀粉的分子量分布见图3可 以 看 到.对于Cocodrie直链淀粉，从75^90C浸出的直链淀粉的分子量分布十分相似。而对于L-205和Koshi，在90℃浸出的直链淀粉的分子量分布与其它温度相比较有明显的不同。由于直链淀粉含量越低，越有利于淀粉颗粒的受热膨胀，而高含量的直链淀粉，则会抑制淀粉颗粒的受热膨胀[141 因此，在高温下.低直链淀粉含量的淀粉颗粒更容易受热膨胀直至破损，不仅直链淀粉会浸出溶解到溶液中甲也导致部分支链淀粉随之溶出到溶液中，而溶出的支链淀粉很容易与链长较长的直链淀粉缠绕聚集。因此，在90℃时，当取样离心后，支链淀粉与长链的直链淀粉的聚集体就很容易沉淀下来，当取上清液进行分子量测量时，会得到偏小的分子量分布，致使分子量分布直线向下偏离。所以，当温度高于90℃时，己经不适于直链淀粉的分离。在低于90)C时，不同温度下浸出的直链淀粉有十分相似的分子量分布。通过Astra软件进行计算处理后，可以得到不同温度下浸出的直链淀粉的重均分子量(Mw)和分子平均旋转半径(RMS)，见表2舍 去 高 温 90V，从表2可以看到，经过分离以后得到的直链淀粉的重均分子量范围为3.29X 10'-2.75XIf]d，这比2. 2中未分离直链淀粉之前测得的淀粉的重均分子量小很多，也与文献报道的直链淀粉的分子量十分接近[-lsl。同时可以看出，L-205和Koshi在90C得到的直链淀粉的Mw明显低于在其温度得到的直链淀粉的Mw，而Cocodrie却与二者不同，在900C得到的直链淀粉的Mw与在其它温度得到的直链淀粉的Mw相差不大，这与图3中给出的分子量分布的结果是一致的。但是，分子平均旋转半径RMS并没有随温度有显著的变化。因为随着温度的升高，虽然会有一小部分支链淀粉也随着直链淀粉一起溶出并形成聚集体，但大部分聚集体经过离心以后已经被除去。

 

3 直链淀粉含量仪分析试验结论
1) 直 链 淀粉和支链淀粉虽然在分子量上存在很大的差异，但其旋转半径非常接近，在通过高效液相分子排阻色谱(HPSEC)分离时，无法实现直链和支链淀粉的有效分离。只有将直链淀粉分离出来，才能测定其分子量分布情况。
2) 用 流 变仪控制大米淀粉的升温糊化过程，用浸出法来分离直链淀粉是一种有效的方法。高温(高于9D C)不利于直链淀粉含量低的大米淀粉用浸出法分离直链淀粉，当温度低于90C而高于糊化温度时，各个温度下均可用浸出法分离出直链淀粉，得到的直链淀粉具有十分相似的分子量分布、重均分子量和分子旋转半径。
3) 使 用 流变仪分离直链淀粉，结合高效液相分子排阻色谱(HPSEC)、多角度光散射仪(MALLS)及折光检测器(RI)连用系统，能够较准确的测定出大米直链淀粉的分子量分布和分子旋转半径，与国外的研究比较[za]，更为简便快速。

 

   相关标准：GB 1354-2009 大米

                 GB 2715-2005 粮食卫生标准

                 GB 2760-2014 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准

                 GB 7718-2004 预包装食品标签通则

                  GB 28050-2011 食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则